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Jun 26, 2023

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Scientific Reports volume 13, Artigo número: 2934 (2023) Citar este artigo 943 Acessos 3 Detalhes da Altmetric Metrics A interação real entre espécies sinalizadoras em processos celulares é frequentemente

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 2934 (2023) Citar este artigo

943 acessos

3 Altmétrico

Detalhes das métricas

A interação real entre espécies sinalizadoras em processos celulares é muitas vezes mais importante do que os seus níveis de expressão. A transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) é uma ferramenta popular para estudar interações moleculares, uma vez que é altamente sensível à proximidade na faixa de 2–10 nm. O FRET quantitativo (3 cubos) corrigido por transbordamento espectral é uma abordagem econômica e versátil, que pode ser aplicada em citometria de fluxo e várias modalidades de microscopia de fluorescência, mas pode ser dificultada por vários níveis de autofluorescência. Aqui, implementamos a correção de autofluorescência pixel por pixel em medições FRET de microscopia, explorando padrões de calibração livres de células sem autofluorescência que permitem a determinação correta de todos os fatores de transbordamento espectral. Também apresentamos um plugin ImageJ/Fiji para análise interativa de imagens únicas, bem como criação automática de mapas quantitativos de eficiência de FRET a partir de grandes conjuntos de imagens. Para validação, usamos modelos FRET baseados em esferas e células cobrindo uma faixa de relações de sinal para autofluorescência e eficiências de FRET e comparamos a abordagem com autofluorescência média convencional/correção de fundo. A correção de autofluorescência pixel por pixel provou ser superior na precisão dos resultados, particularmente para amostras com autofluorescência espacialmente variável e baixas taxas de fluorescência para autofluorescência, sendo esta última frequentemente o caso para níveis de expressão fisiológica.

A transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) é uma transferência de energia não colisional e não radiativa entre um corante doador fluorescente e um corante aceitador espectralmente adequado, que, para fins práticos, é frequentemente escolhido para ser fluorescente . A partir do final da década de 1960, o FRET tornou-se gradualmente uma ferramenta popular para determinar a proximidade entre macromoléculas. A eficiência da transferência de energia (E) é uma função da sexta potência inversa da distância entre os corantes doador e aceitador, que muda rapidamente na faixa de 2–10 nm. Essa faixa de sensibilidade serve de base para estabelecer e comparar interações em nível molecular, mesmo em instrumentos ópticos que, de outra forma, são limitados a um menor poder de resolução devido à difração2. Mesmo com as técnicas de super-resolução em rápida melhoria empurrando o limite de resolução cada vez mais para baixo, ainda resta muito espaço para técnicas FRET3. Há uma grande variedade de abordagens para medir FRET em microscopia4, desde medições de moléculas únicas5,6 até abordagens de conjunto, muitas das quais não requerem instrumentação cara e/ou não são destrutivas para a amostra7,8,9. Estes abrangem métodos raciométricos que são melhor utilizados no campo cada vez maior de biossensores baseados em proteínas fluorescentes com estequiometria de doador/aceitador conhecida, bem como modalidades de medição quantitativa que produzem eficiência de FRET calibrada independente da estequiometria de doador/aceitador. Destes, a imagem de fluorescência vitalícia (FLIM) representa um método intrinsecamente quantitativo, mas requer instrumentação avançada , enquanto o FRET corrigido por transbordamento espectral (ou três cubos) é uma abordagem econômica e versátil, que pode ser aplicada em citometria de fluxo e convencional Microscópio Fluorescente. Ao contrário da também popular técnica de fotobranqueamento aceitador14,15, ela também pode ser usada em conjunto com lapso de tempo e análise de imagens 3D11,16.

A principal limitação em todos os métodos de medição de FRET é a relação sinal-ruído (SNR). SNR é o valor esperado do sinal dividido pelo seu SD. Aqui, o ruído de todas as intensidades de fluorescência medidas usadas em cálculos adicionais se propaga na eficiência do FRET. Assumindo uma distribuição Poissoniana de fótons detectados por pixel com valor esperado λ, se o ruído sistemático for insignificante, o SNR é √λ, portanto, espera-se que intensidades mais baixas aumentem a incerteza do FRET E determinado em maior extensão. Amostras com baixo SNR podem ser mais acessíveis à análise FRET, melhorando a eficiência quântica e a fotoestabilidade dos corantes fluorescentes, usando detecção mais eficiente, otimizando os pares de corantes FRET 18,19 e por abordagens matemáticas e estatísticas aprimoradas 20,21,22, 23. O uso do método corrigido por transbordamento espectral geralmente permite concluir sobre as interações moleculares existentes quando uma eficiência de FRET de ~ 5% ou superior é observada.